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    【外泌體科普5】外泌體糖鏈分析建議

    來源:作者:人氣:-發表時間:2019-11-14 09:30:00【
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    細胞分泌的細胞外囊泡中,粒徑為100 nm左右的囊泡稱為外泌體,外泌體內含有固有的蛋白以及microRNA等。另外,由于表面存在脂質和糖蛋白,外泌體成為繼血液循環腫瘤細胞和血液循環DNA后的第三個被關注的液體活檢標記物,并且現在世界各國也競相開展以microRNA、蛋白組學分析為中心的研究。外泌體的最外層與細胞一樣被糖鏈覆蓋,在外泌體標記開發中糖鏈可作為合適的標靶。用于臨床上的腫瘤標記物識別多種不同糖鏈結構,如果可以捕捉到疾病特異性外泌體上糖鏈的變化 ,則可以期待將外泌體應用于生物標記的開發。
    大部分蛋白在經過糖基化等翻譯修飾后都可作為功能蛋白發揮作用。糖鏈被稱為繼基因、蛋白質之后的第三生命鏈,并與細胞增殖、分化、細胞應答等多種生命現象相關。另外,癌癥、免疫疾病、感染病、阿爾茨海默癥等大多是與糖鏈相關的疾病,尤其是癌癥,癌癥的轉移、侵襲、增殖等已闡明了糖鏈的重要性。在癌癥的診斷、治療法的開發中,對于糖鏈研究的期待值很高,闡明糖鏈的分子生物學意義已成為重要的課題之一。
    與鏈狀的核酸和氨基酸序列相比,糖鏈存在多樣性的分支和不同的結合形式(α,β- 結合),糖鏈不能像核酸那樣擴增,并且只限使用蛋白質樣探針(抗體)進行解析,這使得糖鏈的分析更為困難。然而,最近以質譜,微陣列技術為中心的糖鏈分析技術發生了驚人的革新,迄今為止已經報道了許多新的糖鏈腫瘤標記以及開發方法的案例。糖鏈這種高門檻的研究,隨著這些技術的革新,現在使得每個人都可以輕松地進行分析研究。至今為止,研究人員利用結構特異性識別糖鏈的結合蛋白,并固定了幾十種凝集素的凝集素微陣列系統,進而促進了各類糖鏈生物標記物的開發。
    本方法最大的優點是與質譜分析相比,其靈敏度與通量方面更為優越(圖1)。作為本系統應用的一環,能夠實施對多種生物樣本進行解析的實驗方案,現在,凝集素陣列(Lectin‐Array)分析的對象涉及多方面,如體液、組織、細胞等等。粒子狀的外泌體與細胞相比粒徑雖然很小,但其表面卻存在無數的糖蛋白、糖脂糖鏈。因此,可以成為很好的凝集素陣列分析對象。凝集素陣列(Lectin‐Array)分析是通過幾十種的凝集素結合方式來推斷糖鏈結構,進而發現與比較對象有差異的糖鏈(凝集素)模式,這被稱為糖鏈分析。我們采用的外泌體分析實驗是將提純的外泌體粒子上的蛋白標記熒光。因此,外泌體的回收及其顆粒形態的保持是十分重要的。另外,因為凝集素微陣列具有高靈敏度,即使回收量低也可以進行分析,但是如果混入其他糖蛋白的話就會造成干擾,無法進行正確的糖鏈分析。因此,對提取的外泌體的純度是有要求的。
    為了能夠得到高純度并保持完整顆粒狀態的外泌體,使用MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS (下文簡稱為MagCapture)進行了外泌體提取實驗。該試劑盒在后述的血液中外泌體糖鏈分析時發揮了出色的作用。
    凝集素微陣列系統和外泌體糖鏈分析的流程
    圖1. 凝集素微陣列系統和外泌體糖鏈分析的流程
    首先,我們以培養細胞作為模型,從培養上清中分離、提取外泌體,接著嘗試通過凝集素微陣列進行糖鏈分析比較。作為比較對象,從相同細胞株的沉淀中提取細胞膜蛋白,并對蛋白上的糖鏈進行分析比較(圖2)。從3種類型的胰腺癌細胞株(Capan-1,-2, HPAF-II)中獲得的凝集素陣列數據進行層次聚類分析后發現,這些數據不是反映細胞株之間的差別,而是出色地反映出了膜蛋白和外泌體之間凝集素的差異(圖2A)。說明了即使是相同的細胞株,其細胞膜糖蛋白上糖鏈和分泌的外泌體上糖鏈的結構也是不同的。另外,即使都是外泌體,它詳細的糖鏈圖譜結果也是不同的(圖2B),由此可以看出,將外泌體用作糖蛋白分析比較的標記是可行的。
    胰腺癌細胞來源外泌體和細胞膜糖蛋白的糖鏈比較圖
    圖2. 胰腺癌細胞來源外泌體和細胞膜糖蛋白的糖鏈比較圖
    (A)通過層次聚類分析進行clustering
    (B)各細胞株來源細胞膜蛋白,外泌體表層糖鏈的凝集素陣列結合形式
    以培養上清液作為模型的外泌體分析已取得了一定程度的進展。進行血清來源外泌體的比較分析時,由于含有混雜的糖蛋白,因此要極為小心。換言之,在進行血液中外泌體糖鏈分析時,提取高純度的外泌體是十分重要的。
    比較了超離法、聚合物沉淀法和MagCapture三種外泌體提取方法并進行糖鏈的分析。使用超離法和聚合物沉淀法時,健康者和癌癥患者的糖鏈分析結果的差異不是很大。原因是用該類方法提取的外泌體組分用電泳分析后,可以看到過量的以球蛋白為首的血清糖蛋白的條帶,這會干擾糖鏈的分析比較。
    而血清外泌體糖鏈分析中,使用可以提取高純度外泌體的MagCapture可能是最合適的試劑盒。最后根據MagCapture試劑盒提取外泌體的實驗流程,作為凝集素陣列分析中必要使用的外泌體量,在換算后僅相當于數微升的血清樣品量,因此,確認該方法可以用于血液中高靈敏度的外泌體糖鏈分析比較實驗。并且本試劑盒提取的外泌體可以很好的保持完整顆粒狀態。根據該實驗流程,實際上可以在健康者和疾患群(A、B、C)混合血清中進行外泌體的比較糖鏈分析。分析主要成分的結果中顯示,各患者血清外泌體表層的糖鏈分析結果都有所不同(圖3),建議將外泌體糖鏈作為新的外泌體診斷指標。
    血清外泌體的比較糖鏈分析圖
    圖3. 血清外泌體的比較糖鏈分析圖
    (A)各混合血清中提取外泌體的銀染和抗CD63抗體蛋白印跡
    (B)使用了凝集素陣列分析數據的主要成分分析
    現在正在嘗試開發臨床應用的糖鏈外泌體標記物。以基因組和蛋白組學分析為中心的外泌體的本質正逐漸被闡明。近年,隨著不斷創新的血液中外泌體檢測方法的開發,對外泌體進行定量檢測成為了可能,使其臨床應用也更進了一步。如果可以發現疾病特異性外泌體糖鏈,就可以期待應用這樣創新的外泌體定量系統,開發出實用的標記物。通過與其他組學分析的結合,發現特異性糖鏈的驗證方法等還有很大的改良空間,但是我們已經邁出了外泌體糖鏈標記物開發的第一步。
    參考文獻
    1)Kuno, A. et al. : Nat. Methods, 2, 851 (2005).
    2)Matsuda, A. et al. : Hepatology, 52, 174 (2010).
    3)Matsuda, A. et al. : Anal. Chem., 87, 7274 (2015).
    4)Yoshioka, Y. et al. : Nat. Commun., 5, 3591 (2014).
    5)Kabe, Y. et al. : Clin. Chem., 64, 1463 (2018).
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